罗氏新型Prot-2+1 TCB抗体
抗体密码 · 02期
Glofitamab是靶向CD20XCD3的T细胞双特异抗体，抗体的结构形式为“2+1”（CD20-TCB），即有两个CD20结合位点和一个CD3结合位点。一期临床数据显示该抗体在B-NHL上具有强大强大的疗效，并且具有更持久的缓解和可控的安全性。
CD20-TCB的成功激发了研究者更广泛的探索，依据此抗体的结构形式，罗氏还构建了治疗实体瘤的相关抗体，如CEA-TCB（RO6958688）和FOLR1-TCB等。
CEA-TCB临床前数据表明，抗体可以特异性的结合CEA高表达的肿瘤细胞（CEA抗原表达大于10000），并激活T细胞对肿瘤细胞进行杀伤，但是无法结合CEA地表达的正常细胞（CEA抗原表达低于10000）。
目前该抗体已经完成了一期临床，并且具有一定的疗效。但是在FOLR1-TCB临床前实验中，较低的抗体剂量即可引发on-target off-tumor毒副反应，为了解决TCB抗体的on-target off-tumor效应，罗氏在TCB的基础上进行改进，发明了Prot-TCB。
图1 Prot-TCB作用机制
Prot-TCB设计思路
与原来的TCB不同，Prot-TCB将结合CD3抗原的Fab置于长臂的顶端，同时在此Fab上融合了抗此Fab的单链抗体scFv（Anti-idiotypic anti-CD3）。
Fab和scFv的连接通过特异性酶切位点，在肿瘤中，该位点被酶特异性切割，并暴露CD3结合位点，激活T细胞对肿瘤细胞进行杀伤，在正常的组织中，该位点无法被切割，因此抗体无法结合CD3抗原激活T细胞。
图2 酶特异激活CD3-IgG 和TCB抗体设计
激活的Prot-TCB对CD3抗原的结合
为了验证酶切后的Prot-TCB是否可以有效的结合CD3抗原，作者利用电镜对抗体结构进行观察，负染结果表明，激活后的抗体在结合融合Fc的CD3抗原后结构发生明显改变，这表明抗体经过酶切后不影响抗体对CD3抗原的结合
图3 负染电镜检测激活后的Prot-TCB抗体的活性
抗原表达水平决定Prot-TCB抗体对CD3结合位点的遮挡效率
体外实验证明，Prot-TCB对肿瘤细胞的杀伤具有剂量依赖性（图4a-4f），而利用不可切割的连接子的TCB，在抗体在较高的浓度下才会有较弱的效果，或者没有效果。
不同抗原浓度细胞的杀伤效果和颗粒酶B的检测结果证明Prot-TCB（Prot-FOLR-TCB,MMP-matA site）对肿瘤细胞的抑制效果与抗原水平相关，当抗原水平较高时，Prot-FOLR-TCB,MMP-matA site的效果和FOLR-TCB的效果相当；当抗原水平较低时，Prot-FOLR-TCB,MMP-matA site有较弱的剂量依赖细胞毒性和颗粒酶B释放。
图4 不同抗原密度的癌细胞检测Prot-FOLR1-TCB的药效
肿瘤组织对Prot-FOLR1-TCB的激活
来源于肿瘤的组织未经消化直接和含有不同酶切位点的Prot-FOLR1-TCB孵育后检测T细胞的激活。
结果表明，在正常组织中（含有FOLR1靶点的正常组织），任何酶切位点的Prot-FOLR1-TCB都没有激活T细胞，但是FOLR1-TCB却可以激活T细胞（图5a）；在肿瘤组织中，含有不同酶切位点的Prot-FOLR1-TCB有不同的激活效率，有的甚至高于FOLR1-TCB（图5b，5c）。
这些结果证明，Prot-FOLR1-TCB可以在肿瘤组织中被特异性激活，但是不同的酶切位点有不同的激活效率。
图5 Prot-FOLR1-TCB可以被病人来源的卵巢癌组织特异性激活
Prot-FOLR1-TCB在血液中的稳定性
将含有不同酶切位点的Prot-FOLR1-TCB静脉注射如健康小鼠体内验证Prot-FOLR1-TCB的稳定性，抗体被注射7天后，含有MMP-matA site酶切位点的抗体有约35%被激活，而含有单个酶切位点的MatB和matC仅有约5%被激活，这说明含有单个酶切位点MatB或者matC的抗体更稳定。
图6 含有不同酶切位点Prot-FOLR1-TCB的稳定性
PDX BC004动物模型验证Prot-FOLR1-TCB的有效性
病人来源的组织动物模型实验显示，含有matB酶切位点的Prot-FOLR1-TCB具有更好的抑制肿瘤的效果，甚至于FOLR1-TCB效果相当。
而含有不可切割的linker的Prot-FOLR1-TCB，其药效与溶剂效果相当，几乎没有抑制肿瘤的效果。在含有matB酶切位点的Prot-FOLR1-TCB治疗的动物中，CD3阳性T细胞的数量最多，甚至优于FOLR1-TCB的治疗组。
这些结果证明，Prot-FOLR1-TCB可以特异性的在肿瘤中激活T细胞，并抑制肿瘤的生长。
图7 Prot-FOLR1-TCB在PDX BC004动物模型中药效
TCB双特异抗体在血液瘤中具有较好的治疗效果，但是在实体瘤中却差强人意，这主要是因为实体瘤中的靶点多数也表达于正常组织，因此会形成On-target off-Tumor效应。
罗氏发明的Prot-TCB 双特异抗体平台，利用肿瘤中表达的酶，在肿瘤微环境中特异性激活抗体，而在正在组织中，该抗体无法被激活，从而避免了抗体的On-target off-Tumor效应。
目前已有多种平台利用肿瘤中特异表达的酶特异性激活抗体，如Probod，SAFEbody等，也有利用肿瘤微环境的低PH激活抗体的技术，如CAB等。这些技术应用可以提高抗体的用药剂量，从而扩大治疗窗口，因此将会有较好的治疗前景。
参考文献：
1、Martina Geiger, Kay-Gunnar Stubenrauch3, Johannes Sam et al. Protease-activation using anti-idiotypic masks enables tumor specificity of a folate receptor 1-T cell bispecific antibody. NATURE COMMUNICATIONS 2020
2、Marina Bacac (Dr.), Christian Klein & Pablo Umana. CEA TCB: A novel head-to-tail 2:1 T cell bispecific antibody for treatment of CEA-positive solid tumors. OncoImmunology 2016
3、Martin Hutchings, Franck Morschhauser,; Gloria Iacoboni et al. Glofitamab, a Novel, Bivalent CD20-Targeting T-Cell–Engaging Bispecific Antibody, Induces Durable Complete Remissions in Relapsed or Refractory B-Cell Lymphoma: A Phase I Trial. J Clin Oncol 2021
BiG专栏作者
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